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JMC | 暨南大学药学院陆小云教授团队报道新型FGFR4可逆共价抑制剂用于抗肝癌药物研究

iDRUGS 2022-11-07 00:00

近日， 暨南大学药学院 陆小云研究员联合 中南大学湘雅医院陈永恒教授以及 奥克兰大学Jeff B. Smaill教授，在药物化学TOP期刊 Journal of Medicinal Chemistry 杂志上报道了 FGFR4高活性、强选择性的可逆共价抑制剂最新研究成果。

代表化合物 10z不仅具有显著的选择性抑制野生型FGFR4激酶的活性，还对其守门残基突变体（V550L和V550M）在细胞内外具有强效抑制活性。体外测试中，化合物 10z对三种肝癌细胞的抗肿瘤活性达到几十纳摩尔水平（HeP3B I C ₅₀ = 37 nM、Huh-7 I C ₅₀ = 32 nM、JHH-7 I C ₅₀ = 94 nM），为靶向FGFR4抗肿瘤药物的研究提供了先导化合物。

图1. 新型FGFR4抑制剂及其结合模式

据报道，肝癌占全球癌症死亡病例数的第三，一线靶向治疗药物例如索拉非尼（Sorafenib）、乐伐替尼（lenvatinib）和多纳非尼（Donafenib）等多靶点激酶抑制剂，在使用过程中具有各种毒副作用例如手足综合征等，并且容易发生耐药，治疗效果有限，因此亟需开发新的选择性靶向药物治疗肝癌。

多项基础研究数据表明FGFR4-FGF19信号与肝癌的发生、发展和不良预后密切相关。目前，以FGFR4为靶点的治疗肝癌小分子BLU554和FGF401等处于临床二期研究。但是在临床试验中发现靶点守门残基突变，例如FGFR4V550L和FGFR4V550M会导致BLU554发生获得性耐药。此外，进一步的研究显示肝细胞中FGFR4再合成速率快（T1/2 < 2 h），常规的共价抑制剂难以克服这种缺点，因此，开发出具有持续高效的FGFR4野生和突变蛋白的可逆共价抑制剂，对FGFR4信号异常的肝癌治疗具有很好的前景。

图2. 选择性FGFR4共价抑制剂

为寻找结构新颖的FGFR4选择性抑制剂，研究人员以诺华公司筛选的化合物 7为先导，采用骨架跃迁和基于结构的药物设计策略，将化合物 7的喹啉环替换成吡唑并[1,5-a]嘧啶和吡咯并[3,2-b]吡啶骨架，并保留FGF401中吡啶上氰基和甲氧基乙胺，分别得到的化合物 9和 10a均具有优异的FGFR4激酶抑制活性，但是在工具细胞BaF3-FGFR4测试中发现，化合物 10a具有更好的抗增殖活性，因此以 10a为先导进行后续研究。

图3. 优化设计思路

首先对吡咯N原子上 R ₁进行不同类型和长度的烷基链取代，发现化合物均具有优异的激酶抑制活性和亚型选择性（FGFR1-3, I C ₅₀ >10 μM），代表性化合物 10d（PDB：7YC1）的共晶结构表明吡咯N上的正丙基和吡啶环上的甲氧基乙胺伸向溶剂区，吡啶N和氰基直接或间接的和激酶的氨基酸形成氢键作用，但上述化合物对HeP3B的抗肿瘤活性一般（ I C ₅₀ = 0.58-35.4 μM)。为了提高化合物的细胞活性，接下来在伸向溶剂区的甲氧基乙胺R2部位做改造，通过替换不同长度和类型的亲水链均能提高FGFR4激酶抑制活性，但细胞活性没有提高（HeP3B I C ₅₀ = 12-27.1 μM)。将氰基去掉或者换成Cl和C F ₃，化合物的生物活性都下降，结合 10d的共晶结构表明，CN通过水分子介导与Lys503和Asp630的氢键作用对化合物结合活性是必要的。

图4. 化合物10d及10t与FGFR4的共晶结构

肝细胞中富含各种各样的代谢酶，吡啶5-位醛基容易被代谢，作者考虑通过在醛基邻位引入不同取代基，增加醛基附近的空间位阻降低其代谢，提高对肝细胞增殖抑制活性。结果表明，4-甲基-2-氧代哌嗪基-甲基或溴原子的引入，都可以非常显著地提高化合物的抗肿瘤活性，溴原子在BaF3-FGFR4V550L和BaF3-FGFR4V550M细胞中，抗增殖活性较好。为了更进一步再提高化合物的抗肿瘤活性，作者解析了FGFR4与化合物 10t的共晶结构（PDB：7YC3），空间结构显示 10t具有与 10d相似的结合模式，溴原子和乙基吗啉伸向溶剂区，其他部分的作用力一致。进一步分析发现甲氧基乙胺指向由氨基酸Asn557、Asn617、Leu619以及Asp630形成的蛋白口袋，在上面的改造例子中表明这个位置引入不同亲水链能提高激酶抑制活性，但是不能改善抗肿瘤活性。因此，研究人员设想在这个口袋中引入不同芳环或芳杂环片段，通过增加额外的作用力，能否提高化合物的抗肿瘤效果？

根据此设计思路合成了多个化合物，最终得到活性最好的化合物 10z 。 10z与FGFR4V550L（PDB：7YBP）以及FGFR4V550M（PDB：7YBX）的晶体结构表明3,5-二氯吡啶基团远离突变后残基，并与Asn557形成氢键作用。作者通过质谱、细胞内洗脱实验证实了化合物与FGFR4以可逆共价方式结合，免疫印迹实验证明 10z通过抑制FGFR4及下游信号蛋白AKT和MAPK的磷酸化，起到抗增殖的效果；在铰链区含有半胱氨酸的66个激酶测试中， 10z具有优越的FGFR4激酶选择性。遗憾的是 10z在小鼠体内口服生物利用度较差（F% = 1.1）。研究人员目前正在进行新一轮优化，旨在提高抗肿瘤活性和改善醛基代谢稳定性方面的工作，有望得到具有成药性好的分子。

图5. 化合物10z与FGFR4V550L以及FGFR4V550M复合物结构

图6. 10z与FGFR4以可逆共价方式结合

图7. 10z的激酶选择性

论文第一作者为暨南大学药学院博士研究生杨芳和中南大学湘雅医院 陈小娟博士，通讯作者为暨南大学药学院 陆小云研究员、中南大学湘雅医院 陈永恒教授以及奥克兰大学 Jeff B. Smaill博士。该研究获得科技部重点研发计划国际合作项目和国家自然科学基金资助。

原文： Fang Yang, Xiaojuan Chen, Xiaojuan Song, Raquel Ortega, Xiaojing Lin, Wuqing Deng, Jing Guo, Zhengchao Tu, Adam V. Patterson, Jeff B. Smaill*, Yongheng Chen*, and Xiaoyun Lu*. Design, Synthesis, and Biological Evaluation of 5-Formyl-pyrrolo[3,2-b]pyridine-3-carboxamides as New Selective, Potent, and Reversible-Covalent FGFR4 Inhibitors. J. Med. Chem ., 2022, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01319.